Основа живой клетки — белки. Это полимерные вещества, молекулы которых состоят из большого числа остатков различных аминокислот. Всего аминокислот, входящих в состав белков, известно двадцать.
В природе существует огромное многообразие белков, отличающихся один от другого не только длиной цепи и относительным содержанием аминокислот, но и порядком их чередования. В живой клетке происходит непрерывный процесс распада и синтеза белков. Первичная информация о строении белков данной клетки и программа их синтеза содержатся в нуклеиновых кислотах клеточного ядра. Синтез белка в клетке осуществляют и регулируют нуклеиновые кислоты, выполняющие роль матриц (шаблонов).
Нуклеиновые кислоты
Нуклеиновые кислоты — линейные (неразветвленные) полимерные цепи, составленные из большого числа звеньев, так называемых нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из трех частей: азотистого основания, сахара и остатка фосфорной кислоты. Небольшой участок молекулы нуклеиновой кислоты, включающий три нуклеотида, показан на схеме слева.
Известны два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновые (РНК) и дезоксирибонуклеиновые (ДНК). Главное различие между ними заключается в том, что в РНК сахаром служит рибоза, а в ДНК — дезоксирибоза. Молекула рибозы содержит четыре группы ОН, молекула дезоксирибозы — только три (см. схему справа).
В нуклеотидах, образующих РНК, встречаются азотистые основания четырех типов: два пиримидина (урацил и цитозин) и два пурина (аденин и гуанин), — это показано на нижней схеме.
Эти основания могут присоединяться к рибозе, давая соединение, называемое нуклеозидом. Если присоединить к нуклеозиду остаток фосфорной кислоты
то получится нуклеотид. Нуклеотиды могут легко соединяться друг с другом, образуя длинные полимерные цепи — полинуклеотиды, которые биохимики с давних пор называют нуклеиновыми кислотами.
Какие бывают РНК?
Известны три типа РНК. Они выполняют разные функции и отличаются друг от друга длиной молекулярных цепей.
- Рибосомальная РНК (р-РНК). Входит в состав рибосом — мелких частиц в цитоплазме клетки, участвующих в синтезе белка. Ее молекулы — самые длинные.
- Информационная РНК (и-РНК). Переносит информацию из ядра клетки (от ДНК) к месту синтеза белка — в рибосомы. Молекулы этой РНК несколько короче, чем молекулы р-РНК.
- Транспортная РНК (т-РНК). Присоединяет какую-либо определенную аминокислоту (одну из двадцати), транспортирует ее в рибосому и включает в нужное место синтезируемой молекулы белка. Длина молекул т-РНК, как правило, в несколько раз меньше, чем молекул и-РНК.
Сущность открытия
Основной характеристикой каждой нуклеиновой кислоты является последовательность нуклеотидов в ее молекулах. Это и определяет ее «специфичность». До последнего времени установить последовательность нуклеотидов хотя бы в одной из нуклеиновых кислот никому не удавалось, несмотря на то, что этой проблемой занималось большое число ученых в разных странах. Решили задачу совсем недавно, в январе 1965 года, американский биохимик Р. У. Холли и его сотрудники. Об’ектом их исследований была одна из т-РНК, которая, присоединяя аминокислоту аланин, переносит ее в рибосому для включения в синтезируемый белок; ее называют аланиновой т-РНК.
Ученые установили, что ал-т-РНК содержит 77 нуклеотидов: из них 67 — «обычных». 9 — «необычных», называемых минорами (они на рисунке заштрихованы); один нуклеотид, обозначенный до сих пор у*, точно идентифицировать не удалось. Конец молекулы ал-т-РНК, которым она соединяется с аланином, завершается тройкой нуклеотидов — ЦЦА (цитозин — цитозин — аденин). Любопытно, что молекулы всех т-РНК, а не только ал-т-РНК, заканчиваются этой тройкой.
Миноры
Минорные нуклеотиды, или миноры, встречаются значительно реже, чем обычные. Они были впервые обнаружены в нуклеиновых кислотах в 1958 году. Миноры, как и обычные нуклеотиды, состоят из азотистого основания, рибозы и остатка фосфорной кислоты. Разница заключается лишь в некотором отличии строения азотистого основания. Исключением является псевдоуридин, в котором урацил связан с рибозой не через азот, как в обычном нуклеотиде, а через углерод. Ниже схеме на приведены названия минорных нуклеотидов.
Минорные нуклеотиды имеются не только в т-РНК. Однако в других нуклеиновых кислотах их содержится значительно меньше, чем в т-РНК. Существует много предположений о роли миноров, но все они довольно неопределенны. Здесь — завтрашний день науки…
Как велась расшифровка
Расшифровка структуры таких сложны) полимеров, как нуклеиновые кислоты V белки, связана с огромными трудностями Еще несколько лет назад ни один ученый не мог даже приблизительно указать возможный способ выяснения порядка чередования нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. Прежде всего представлялось чрезвычайно сложным выделить препарат индивидуальной РНК из природной смеси близких по молекулярному весу РНК, отличающихся последовательностью расположения нуклеотидов. Лишь когда было установлено, что каждой аминокислоте соответсвует своя т-РНК, появилась принципиальная возможность — а с нею и надежда— выделить индивидуальную т-РНК из смеси.
Начались поиски… Обсуждался, например, такой способ:, «нагрузить» индивидуальную т-РНК соответствующей ей аминокислотой, выделить из смеси комплекс «т-РНК — аминокислота», разложить его на составные части и таким образом получить индивидуальную т-РНК. По этому пути устремилось большое число ученых. Но возникло новое затруднение: оказалось, что с одной и той же аминокислотой могут связываться несколько различных т-РНК, а не одна.
Группа Холли с самого начала пошла другим путем. Исследователи применили для разделения природной т-РНК известный до этого тонкий физико-химический метод, называемый методом противоточного распределения. Он оказался в этом случае особенно эффективным. Ученым удалось получить препарат индивидуальной ал-т-РНК, содержавший лишь незначительные примеси других т-РНК. С этим препаратом и приступили к расшифровке…
Другая трудность заключалась в следующем. Требовалось найти агенты, обладающие способностью расщеплять цепь РНК в строго определенных местах, с таким расчетом, чтобы в результате расщепления получался ряд фрагментов (блоков), которые можно было бы мысленно реконструировать в исходную цепь. Аналогичный путь еще в 1958 г. был использован английским ученым Ф. Сэнджэром в его знаменитой работе по расшифровке последовательности аминокислот ь белке инсулине, за которую он был удостоен Нобелевской премии. Сэнджэр в своих исследованиях использовал несколько специфических ферментов (протеаз), каждый из которых расщеплял белковую цепочку между двумя вполне определенными аминокислотами. Метод Сэнджэра основан на различии в устойчивости химических связей между разными аминокислотами при действии на них различных протеаз. С нуклеиновыми же кислотами дело обстоит иначе. Различия в устойчивости связей между разными нуклеотидами при расщеплении их ферментами оказались крайне незначительными. Поэтому в течение длительного времени считалось, что все ферменты, расщепляющее связи между нуклеотидами (РНКазы), не «различают» связей между разными нуклеотидами. Однако не так давно удалось показать, что одна из РНКаз, а именно панкреатическая РНКаза, в какой-то степени специфична, расщепляя только те связи, которые включают пиримидиновые нуклеотиды (У и Ц). Позднее была найдена еще более специфическая РНКаза (РНКаза Т1), которая расщепляет молекулу РНК по гуаниловым нуклеотидам. В результате появилась возможность решить задачу установления последовательности принципиально тем же путем, каким ее решал Сэнджэр для белков.
Ниже приведена схема расщепляющего действия обеих специфических РНКаз, использованных Холли.
Скорость расщепления обеими специфическими РНКазами зависит от температуры, кислотности среды, концентрации фермента и т. д. Это позволило получать при помощи одного и того же фермента блоки разных размеров, действуя одним и тем же ферментом при разных условиях. Именно поэтому двух упомянутых РНКаз практически оказалось достаточно, чтобы группа Холли смогла выполнить свою работу.
Третья трудность, сильно задержавшая окончание работы, заключалась в том, что в составе исследуемой т-РНК оказались еще не известные минорные нуклеотиды (в частности дигидроурацил), которые было трудно идентифицировать, так как обычно используемые методы не позволяли их обнаружить.
Последовательность блоков в исходной молекуле
Обычно последовательность блоков выясняют по следующей схеме. Берут несколько отдельных порций исследуемой т-РНК и подвергают каждую из них расщепляющему действию РНКазы Т1 в разных условиях, в частности при разных температурах. То же делают при помощи панкреатической РНКазы. Благодаря различиям в скорости специфического расщепления получают разные наборы блоков. Чем ниже температура, тем меньше число разрывов, и тем, следовательно, крупнее блоки.
Получающиеся блоки разными способами накладывают друг на друга «внахлест». Находят такой способ, при котором отдельные участки точно совпадают по последовательности нуклеотидов. Этот метод совмещения блоков с их частичным перекрыванием постепенно приводит к установлению последовательности блоков в исходной молекуле.
Чем длиннее цепь полимера и чем меньше число составляющих ее элементов, тем большим должно быть число различных специфических расщеплений для отыскания перекрывающихся участков. Именно поэтому расшифровка структуры нуклеиновых кислот, состоящих из 4 элементов, представляет собой несравненно более трудную задачу, чем расшифровка аминокислотной последовательности в белках, имеющих 20 элементов. С этой точки зрения сравнительно большое число миноров в ал-т-РНК несколько облегчило задачу расшифровки ее структуры: они служили хорошими маркерами при анализе перекрывающихся участков совмещаемых блоков.
Структура отдельных блоков
Не менее сложная задача — установление последовательности нуклеотидов внутри каждого блока. Она решается каждый раз по-разному в зависимости от нуклеотидного состава и длины блока.
В случае динуклеотидов делают простой гидролиз. Тринуклеотиды расшифровывают, отщепляя концевой нуклеотид специальным ферментом (фосфодиэстеразой), добываемым из яда некоторых змей.
В случае более длинных блоков находят иные пути, зачастую требующие большой выдумки и экспериментального мастерства. Проведение этих опытов осложняется ограниченным количеством индивидуальной т-РНК, которую чрезвычайно трудно выделять и очищать.
Выбор был сделан удачно…
В значительной мере успех Холли зависел от правильности выбора объекта исследования. Почему для исследований была взята именно ал-т-РНК?
Во-первых потому, что по сравнению с другими нуклеиновыми кислотами т-РНК имеют наиболее низкий молекулярный вес, то есть содержат наименьшее число нуклеотидов. Молекулярный вес ал-т-РНК, по данным Холли, равен лишь 26 600, тогда как молекулярные веса других видов РНК достигают миллиона, а ДНК десятка и даже нескольких десятков миллионов.
Во-вторых, для т-РНК, в отличие от других нуклеиновых кислот, была надежда разработать метод выделения индивидуальных фракций.
Помимо этих двух причин, существенно также то обстоятельство, что т-РНК хотя и с трудом, но все же может быть получена в сравнительно больших количествах из пекарских дрожжей и некоторых других источников.
Работа, которую провели Холли и его сотрудники, потребовала, по-видимому, не менее нескольких граммов чистой ал-т-РНК. Для столь уникального и трудно получаемого препарата это количество можно считать почти астрономическим!
Холли расшифровал пока только ал-т-РНК, но из предыдущих публикаций известно, что у него в лаборатории были получены очищенные препараты еще двух индивидуальных т-РНК—валиновой и тирозиновой. Ал-т-РНК оказалась, судя по всему, наиболее «податливой» для очистки и расшифровки.
Ближайшие цели?
Можно ожидать, что в ближайшем будущем будут установлены последовательности нуклеотидов в некоторых других т-РНК. Сейчас, по-видимому, нет принципиальных препятствий для решения этой задачи.
Однако на пути к ее осуществлению еще придется столкнуться со многими трудностями технического характера. Такие работы требуют много времени, сил, средств. Недаром за десять лет ученым удалось расшифровать структуру не более 10 белков, хотя метод расшифровки был хорошо известен.
Что касается расшифровки рибосомальных и информационных РНК, а также ДНК, то здесь еще есть трудности принципиального характера. В настоящее время неясно, например, как получить индивидуальные препараты высокомолекулярных РНК и ДНК, а для ДНК до сиу пор не открыты специфические ферменты (ДНКазы), при помощи которых можно было бы расщеплять молекулы ДНК в строго определенных местах. Но даже если бы и удалось получить препараты индивидуальных РНК и ДНК и найти специфические ДНКазы, тем не менее молекулы этих нуклеиновых кислот, по-видимому, слишком длинны для того, чтобы расшифровка их структуры могла быть осуществлена теми же методами, которыми пользовался Холли.
Мы еще не знаем, по какому пути пойдут ученые при расшифровке нуклеотидной последовательности в высокомолекулярных нуклеиновых кислотах. Видимо, для решения этой проблемы придется искать новые методы.
Укажем на одну из гипотетических возможностей. Предположим, мы получили молекулу нуклеиновой кислоты в виде натянутой нити. «Посадим» на все одинаковые нуклеотиды (допустим, на цитозины) атомы тяжелого металла или какие-нибудь большие химические группы и измерим расстояния между соседними «посаженными» группами при помощи электронного микроскопа. Эту операцию повторим для каждого из четырех нуклеотидов, подобрав условия специфической «посадки». Очевидно, расстояния между соседними одинаковыми нуклеотидами, полученные в результате таких опытов, могут дать информацию, достаточную для расшифровки нуклеотидной последовательности.
Но этот путь расшифровки, к сожалению, не может быть реализован в настоящее время. Для него требуется повысить разрешающую способность современного электронного микроскопа, разработать метод получения нуклеиновых кислот в виде натянутых нитей, придумать способы специфической «посадки» атомов тяжелых металлов или крупных химических групп на отдельные нуклеотиды…
Что же касается реальных путей расшифровки первичной структуры высокомолекулярных нуклеиновых кислот, то пока мы их не знаем. Но поиски в этом направлении усиленно ведутся во многих лабораториях мира.
Работы других ученых
Над проблемой расшифровки нуклеотидной последовательности в транспортных РНК работают многие научные коллективы. В нашей стране ею так же увлеченно, как и в США, занимается ряд ученых. Их работа координируется. Интересные результаты достигнуты в трех крупнейших научных институтах: в лаборатории академика В. А. Энгельгардта в Институте радиационной и физико-химической биологии Академии наук СССР (А. А. Баев, Т. В. Венкстерн, Р. И. Татарская, А. Д. Мирзабеков и другие), в лаборатории члена-корреспондента Академии наук СССР Н. К. Кочеткова в Институте химии природных соединений Академии наук СССР (Э. И. Будовский, М. Ф. Турчинский, Н. А. Симукова, В. П. Демушкин и другие) и в лаборатории кандидата химических наук Д. Г. Кнорре в Институте органической химии Сибирского отделения Академии наук СССР (Л. С. Сандахчиев, С. К. Василенко и другие).
В этих трех лабораториях достигнуты большие успехи по определению первичной структуры валиновой т-РНК. Хотя работа еще полностью не закончена, однако уже получены индивидуальные препараты валиновой т-РНК, определен ее нуклеотидный состав, выделено и проанализировано большое число блоков. В ходе работ группой А. А. Баева был разработан новый способ получения чистого препарата РНКазы-Т1 из актиномицетов, а группа Э. И. Будовского применила новый способ расщепления, в основе которого лежит направленное химическое изменение некоторых оснований в исследуемой т-РНК. Этот способ позволяет значительно уменьшить число блоков, необходимое для установления их последовательности в исходной цепи, и, следовательно, сокращает число ферментативных расщеплений.
Над расшифровкой последовательности нуклеотидов в т-РНК работает также ряд ведущих зарубежных лабораторий, возглавляемых известными исследователями: профессором Г. Л. Кантони (США), профессором Г. Цахау (ФРГ), профессором В. М. Ингрэмом (США), профессором М. Штэйлин (Швейцария) и др.
Значение нового открытия
Транспортные РНК играют чрезвычайно важную роль в синтезе белка, «переводя» четырехбуквенный код нуклеиновой кисло’ ты на двадцатибуквенный «язык» белка. Эта их функция универсальна для всех живых организмов, от бактерий до высших млекопитающих.
В результате исследований Холли мы узнали последовательность нуклеотидов, т. е. первичную структуру одной из т-РНК. Это позволяет высказать вполне определенные предположения о форме, которую может приобретать нить т-РНК в пространстве, и помогает нам судить о том, какие из участков цепи играют особенно важную роль в функционировании т-РНК в клетке.
Весьма ценными оказались и сведения о расположении минорных нуклеотидов. До того, как была опубликована работа Холли, считалось, что приблизительно 80 процентов нуклеотидов образуют двунитчатые участки спаренных нуклеотидов (пурин одной нити и пиримидин другой нити), для которых характерно спиральное строение. Из работ Холли следует, что доля спирализованных участков не может быть столь большой. Это связано с тем, что миноры, большинство которых, в отличие от обычных нуклеотидов, с большим трудом образуют спаренные (двунитчатые) участки, не сосредоточены в одном месте, как думали многие ученые, а распределены более или менее равномерно вдоль всей цепи. Ниже показаны некоторые из возможных вариантов пространственного расположения молекулы ал-т-РНК с учетом распределения миноров.
Интересно, что ученые, исследующие проблему стабильности нуклеиновых кислот, придают очень большое значение «кооперативному» характеру взаимодействия между цепочками в двунитчатой структуре, обеспечивающему устойчивость спиральной формы нуклеиновой кислоты. Физический смысл кооперативности состоит в том, что прочность спирального участка должна возрастать по мере увеличения числа спаренных нуклеотидов, образующих данный участок. До работы Холли считалось, что наблюдаемая на опыте устойчивость спиральной структуры нуклеиновой кислоты при температуре живого организма может быть достигнута только при условии, если спиральные участки будут достаточно длинными. Однако исследование Холли показало, что достаточно высокая устойчивость (которой, как известно, обладает т-РНК) достигается уже при сравнительно коротких спиральных участках, включающих всего лишь пять нуклеотидных пар и даже меньше.
Одна из замечательных особенностей молекул т-РНК состоит в том, что, хотя концы всех молекул, к которым присоединяются аминокислоты, одинаковы (ЦЦА), тем не менее каждая из молекул «работает» строго специфически и может присоединять какую-нибудь одну и только одну из двадцати аминокислот, для которой она предназначена.
До сих пор никому не удавалось «обмануть» молекулу т-РНК и «нагрузить» ее не той аминокислотой, для которой она предназначена. Но если изменить аминокислоту уже после того, как она присоединена к т-РНК, то измененная аминокислота легко включается в место белковой молекулы, предназначенное для исходной аминокислоты. Из этого следует, что, если мы хотим направленно изменять структуру белка, то прежде всего должны уметь «нагружать» т-РНК той аминокислотой, которую нужно внедрить в белок, т. е. научиться управлять процессом присоединения аминокислоты к молекуле т-РНК.
После того, как будут расшифрованы последовательности нуклеотидов в других т-РНК, их можно будет сравнить с уже известной нам последовательностью в ал-т- РНК и выяснить, в чем же заключаются различия между разными т-РНК, обусловливающие их специфичность. Тогда, может быть, станет ясно, каким образом молекула т-РНК умеет находить и присоединять именно данную аминокислоту, как она транспортирует ее и включает в белковую цепь. Эти сведения помогут нам научиться изменять по нашему усмотрению аминокислотную последовательность в белках и, следовательно, менять их структуру.
Расшифровка молекулярного строения т-РНК имеет огромное научное значение. Как справедливо указывает Холли в заключение своей статьи, знание нуклеотидной последовательности открывает принципиальную возможность химического синтеза биологически активных нуклеиновых кислот.
Работа Р. У. Холли и его сотрудников может служить яркой демонстрацией того, как достижения науки обгоняют в наши дни даже самые оптимистические прогнозы ученых и какими быстрыми шагами пополняются наши знания о «языке», с помощью которого природа зашифровала свои тайны.
Профессор Я. М. ВАРШАВСКИЙ