Основа живой клетки — белки. Это по­лимерные вещества, молекулы которых со­стоят из большого числа остатков различ­ных аминокислот. Всего аминокислот, вхо­дящих в состав белков, известно двадцать.

В природе существует огромное много­образие белков, отличающихся один от другого не только длиной цепи и относи­тельным содержанием аминокислот, но и порядком их чередования. В живой клетке происходит непрерывный процесс распада и синтеза белков. Первичная информация о строении белков данной клетки и про­грамма их синтеза содержатся в нуклеино­вых кислотах клеточного ядра. Синтез белка в клетке осуществляют и регулируют ну­клеиновые кислоты, выполняющие роль матриц (шаблонов).

Нуклеиновые кислоты

Нуклеиновые кислоты — линейные (неразветвленные) полимерные цепи, состав­ленные из большого числа звеньев, так называемых нуклеотидов. Каждый нуклео­тид состоит из трех частей: азотистого основания, сахара и остатка фосфорной кислоты. Небольшой участок молекулы нуклеиновой кислоты, включающий три нуклеотида, по­казан на схеме  слева.

Известны два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновые (РНК) и дезоксирибону­клеиновые (ДНК). Главное различие между ними заключается в том, что в РНК сахаром служит рибоза, а в ДНК — дезоксирибоза. Молекула рибозы содержит четыре груп­пы ОН, молекула дезоксирибозы — только три (см. схему  справа).

В нуклеотидах, образующих РНК, встре­чаются азотистые основания четырех типов: два пиримидина (урацил и цитозин) и два пурина (аденин и гуанин), — это показано на нижней схеме.

Эти основания могут присоединяться к рибозе, давая соединение, называемое нуклеозидом. Если присоединить к нуклеозиду остаток фосфорной кислоты

то получится нуклеотид. Нуклеотиды могут легко соединяться друг с другом, образуя длинные полимерные цепи — полинуклеоти­ды, которые биохимики с давних пор назы­вают нуклеиновыми кислотами.

Какие бывают РНК?

Известны три типа РНК. Они выполняют разные функции и отличаются друг от дру­га длиной молекулярных цепей.

1. Рибосомальная РНК (р-РНК). Входит в состав рибосом — мелких частиц в цито­плазме клетки, участвующих в синтезе бел­ка. Ее молекулы — самые длинные.
2. Информационная РНК (и-РНК). Пере­носит информацию из ядра клетки (от ДНК) к месту синтеза белка — в рибосомы. Мо­лекулы этой РНК несколько короче, чем молекулы р-РНК.
3. Транспортная РНК (т-РНК). Присоеди­няет какую-либо определенную аминокислоту (одну из двадцати), транспортирует ее в рибосому и включает в нужное место синтезируемой молекулы белка. Длина мо­лекул т-РНК, как правило, в несколько раз меньше, чем молекул и-РНК.

Сущность открытия

Основной характеристикой каждой нук­леиновой кислоты является последователь­ность нуклеотидов в ее молекулах. Это и определяет ее «специфичность». До пос­леднего времени установить последова­тельность нуклеотидов хотя бы в одной из нуклеиновых кислот никому не удавалось, несмотря на то, что этой проблемой зани­малось большое число ученых в разных странах. Решили задачу совсем недавно, в январе 1965 года, американский биохимик Р. У. Холли и его сотрудники. Об’ектом их исследований была одна из т-РНК, кото­рая, присоединяя аминокислоту аланин, пе­реносит ее в рибосому для включения в синтезируемый белок; ее называют аланиновой т-РНК.

Ученые установили, что ал-т-РНК содержит 77 нуклеотидов:       из них 67 — «обычных». 9 — «необычных», называемых минорами (они на рисунке заштрихованы); один нукле­отид, обозначенный до сих пор у*, точно идентифицировать не удалось. Конец моле­кулы ал-т-РНК, которым она соединяется с аланином, завершается тройкой нуклеоти­дов — ЦЦА (цитозин — цитозин — аденин). Любопытно, что молекулы всех т-РНК, а не только ал-т-РНК, заканчиваются этой трой­кой.

Миноры

Минорные нуклеотиды, или миноры, встречаются значительно реже, чем обыч­ные. Они были впервые обнаружены в нуклеиновых кислотах в 1958 году. Миноры, как и обычные нуклеотиды, состоят из азо­тистого основания, рибозы и остатка фос­форной кислоты. Разница заключается лишь в некотором отличии строения азотистого основания. Исключением является псевдоуридин, в котором урацил связан с рибозой не через азот, как в обычном нуклеотиде, а через углерод. Ниже схеме на  приве­дены названия минорных нуклеотидов.

Минорные нуклеотиды имеются не толь­ко в т-РНК. Однако в других нуклеиновых кислотах их содержится значительно мень­ше, чем в т-РНК. Существует много предпо­ложений о роли миноров, но все они до­вольно неопределенны. Здесь — завтраш­ний день науки…

Как велась расшифровка

Расшифровка структуры таких сложны) полимеров, как нуклеиновые кислоты V белки, связана с огромными трудностями Еще несколько лет назад ни один уче­ный не мог даже приблизительно указать возможный способ выяснения порядка че­редования нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. Прежде всего представлялось чрез­вычайно сложным выделить препарат инди­видуальной РНК из природной смеси близких по молекулярному весу РНК, отли­чающихся последовательностью располо­жения нуклеотидов. Лишь когда было установлено, что каждой аминокислоте соответсвует своя т-РНК, появилась принци­пиальная возможность — а с нею и надеж­да— выделить индивидуальную т-РНК из смеси.

Начались поиски… Обсуждался, напри­мер, такой способ:, «нагрузить» индивиду­альную т-РНК соответствующей ей амино­кислотой, выделить из смеси комплекс «т-РНК — аминокислота», разложить его на составные части и таким образом получить индивидуальную т-РНК. По этому пути уст­ремилось большое число ученых. Но воз­никло новое затруднение: оказалось, что с одной и той же аминокислотой могут свя­зываться несколько различных т-РНК, а не одна.

Группа Холли с самого начала пошла другим путем. Исследователи применили для разделения природной т-РНК известный до этого тонкий физико-химический метод, называемый методом противоточного рас­пределения. Он оказался в этом случае особенно эффективным. Ученым удалось получить препарат индивидуальной ал-т-РНК, содержавший лишь незначительные приме­си других т-РНК. С этим препаратом и при­ступили к расшифровке…

Другая трудность заключалась в следу­ющем. Требовалось найти агенты, обладаю­щие способностью расщеплять цепь РНК в строго определенных местах, с таким рас­четом, чтобы в результате расщепления получался ряд фрагментов (блоков), кото­рые можно было бы мысленно реконструи­ровать в исходную цепь. Аналогичный путь еще в 1958 г. был использован англий­ским ученым Ф. Сэнджэром в его знамени­той работе по расшифровке последователь­ности аминокислот ь белке инсулине, за ко­торую он был удостоен Нобелевской пре­мии. Сэнджэр в своих исследованиях исполь­зовал несколько специфических ферментов (протеаз), каждый из которых расщеплял белковую цепочку между двумя вполне определенными аминокислотами. Метод Сэнджэра основан на различии в устойчи­вости химических связей между разными аминокислотами при действии на них раз­личных протеаз. С нуклеиновыми же кисло­тами дело обстоит иначе. Различия в ус­тойчивости связей между разными нуклео­тидами при расщеплении их ферментами оказались крайне незначительными. Поэто­му в течение длительного времени счита­лось, что все ферменты, расщепляющее связи между нуклеотидами (РНКазы), не «различают» связей между разными нук­леотидами. Однако не так давно удалось по­казать, что одна из РНКаз, а именно пан­креатическая РНКаза, в какой-то степени специфична, расщепляя только те связи, которые включают пиримидиновые нуклео­тиды (У и Ц). Позднее была найдена еще более специфическая РНКаза (РНКаза Т₁), которая расщепляет молекулу РНК по гуаниловым нуклеотидам. В результате появи­лась возможность решить задачу установ­ления последовательности принципиально тем же путем, каким ее решал Сэнджэр для белков.

Ниже приведена схема расщеп­ляющего действия обеих специфических РНКаз, использованных Холли.

Скорость расщепления обеими специ­фическими РНКазами зависит от темпера­туры, кислотности среды, концентрации фермента и т. д. Это позволило получать при помощи одного и того же фермента блоки разных размеров, действуя одним и тем же ферментом при разных условиях. Именно поэтому двух упомянутых РНКаз практически оказалось достаточно, чтобы группа Холли смогла выполнить свою ра­боту.

Третья трудность, сильно задержавшая окончание работы, заключалась в том, что в составе исследуемой т-РНК оказались еще не известные минорные нуклеотиды (в частности дигидроурацил), которые было трудно идентифицировать, так как обычно используемые методы не позволяли их об­наружить.

Последовательность блоков в исходной молекуле

Обычно последовательность блоков вы­ясняют по следующей схеме. Берут не­сколько отдельных порций исследуемой т-РНК и подвергают каждую из них рас­щепляющему действию РНКазы Т₁ в раз­ных условиях, в частности при разных температурах. То же делают при помощи панкреатической РНКазы. Благодаря раз­личиям в скорости специфического расще­пления получают разные наборы блоков. Чем ниже температура, тем меньше число разрывов, и тем, следовательно, крупнее блоки.

Получающиеся блоки разными способа­ми накладывают друг на друга «внахлест». Находят такой способ, при котором отдель­ные участки точно совпадают по последо­вательности нуклеотидов. Этот метод сов­мещения блоков с их частичным перекрыва­нием постепенно приводит к установлению последовательности блоков в исходной мо­лекуле.

Чем длиннее цепь полимера и чем мень­ше число составляющих ее элементов, тем большим должно быть число различных специфических расщеплений для отыскания перекрывающихся участков. Именно поэто­му расшифровка структуры нуклеиновых кислот, состоящих из 4 элементов, пред­ставляет собой несравненно более трудную задачу, чем расшифровка аминокислотной последовательности в белках, имеющих 20 элементов. С этой точки зрения сравни­тельно большое число миноров в ал-т-РНК несколько облегчило задачу расшифровки ее структуры: они служили хорошими мар­керами при анализе перекрывающихся участков совмещаемых блоков.

Структура отдельных блоков

Не менее сложная задача — установле­ние последовательности нуклеотидов внут­ри каждого блока. Она решается каждый раз по-разному в зависимости от нуклео­тидного состава и длины блока.

В случае динуклеотидов делают простой гидролиз. Тринуклеотиды расшифровыва­ют, отщепляя концевой нуклеотид специ­альным ферментом (фосфодиэстеразой), добываемым из яда некоторых змей.

В случае более длинных блоков нахо­дят иные пути, зачастую требующие боль­шой выдумки и экспериментального мас­терства. Проведение этих опытов ослож­няется ограниченным количеством индиви­дуальной т-РНК, которую чрезвычайно трудно выделять и очищать.

Выбор был сделан удачно…

В значительной мере успех Холли зави­сел от правильности выбора объекта иссле­дования. Почему для исследований была взята именно ал-т-РНК?

Во-первых потому, что по сравнению с другими нуклеиновыми кислотами т-РНК имеют наиболее низкий молекулярный вес, то есть содержат наименьшее число ну­клеотидов. Молекулярный вес ал-т-РНК, по данным Холли, равен лишь 26 600, тогда как молекулярные веса других видов РНК до­стигают миллиона, а ДНК десятка и даже нескольких десятков миллионов.

Во-вторых, для т-РНК, в отличие от дру­гих нуклеиновых кислот, была надежда разработать метод выделения индивидуаль­ных фракций.

Помимо этих двух причин, существенно также то обстоятельство, что т-РНК хотя и с трудом, но все же может быть получена в сравнительно больших количествах из пекарских дрожжей и некоторых других источников.

Работа, которую провели Холли и его сотрудники, потребовала, по-видимому, не менее нескольких граммов чистой ал-т-РНК. Для столь уникального и трудно получае­мого препарата это количество можно счи­тать почти астрономическим!

Холли расшифровал пока только ал-т-РНК, но из предыдущих публикаций известно, что у него в лаборатории были получены очищенные препараты еще двух индивидуальных т-РНК—валиновой и тирозиновой. Ал-т-РНК оказалась, судя по все­му, наиболее «податливой» для очистки и расшифровки.

Ближайшие цели?

Можно ожидать, что в ближайшем буду­щем будут установлены последовательно­сти нуклеотидов в некоторых других т-РНК. Сейчас, по-видимому, нет принципиальных препятствий для решения этой задачи.

Однако на пути к ее осуществлению еще придется столкнуться со многими трудно­стями технического характера. Такие рабо­ты требуют много времени, сил, средств. Недаром за десять лет ученым удалось рас­шифровать структуру не более 10 белков, хотя метод расшифровки был хорошо из­вестен.

Что касается расшифровки рибосомальных и информационных РНК, а также ДНК, то здесь еще есть трудности принципиаль­ного характера. В настоящее время неясно, например, как получить индивидуальные препараты высокомолекулярных РНК и ДНК, а для ДНК до сиу пор не открыты специфи­ческие ферменты (ДНКазы), при помощи которых можно было бы расщеплять моле­кулы ДНК в строго определенных местах. Но даже если бы и удалось получить препа­раты индивидуальных РНК и ДНК и найти специфические ДНКазы, тем не менее мо­лекулы этих нуклеиновых кислот, по-види­мому, слишком длинны для того, чтобы расшифровка их структуры могла быть осуществлена теми же методами, которыми пользовался Холли.

Мы еще не знаем, по какому пути пой­дут ученые при расшифровке нуклеотид­ной последовательности в высокомолеку­лярных нуклеиновых кислотах. Видимо, для решения этой проблемы придется искать новые методы.

Укажем на одну из гипотетических воз­можностей. Предположим, мы получили молекулу нуклеиновой кислоты в виде на­тянутой нити. «Посадим» на все одинако­вые нуклеотиды (допустим, на цитозины) атомы тяжелого металла или какие-нибудь большие химические группы и измерим расстояния между соседними «посаженны­ми» группами при помощи электронного микроскопа. Эту операцию повторим для каждого из четырех нуклеотидов, подобрав условия специфической «посадки». Очевид­но, расстояния между соседними одинако­выми нуклеотидами, полученные в резуль­тате таких опытов, могут дать информацию, достаточную для расшифровки нуклеотид­ной последовательности.

Но этот путь расшифровки, к сожале­нию, не может быть реализован в настоя­щее время. Для него требуется повысить разрешающую способность современного электронного микроскопа, разработать ме­тод получения нуклеиновых кислот в виде натянутых нитей, придумать способы специ­фической «посадки» атомов тяжелых ме­таллов или крупных химических групп на отдельные нуклеотиды…

Что же касается реальных путей рас­шифровки первичной структуры высокомо­лекулярных нуклеиновых кислот, то пока мы их не знаем. Но поиски в этом направ­лении усиленно ведутся во многих лабора­ториях мира.

Работы других ученых

Над проблемой расшифровки нуклео­тидной последовательности в транспортных РНК работают многие научные коллективы. В нашей стране ею так же увлеченно, как и в США, занимается ряд ученых. Их работа координируется. Интересные результаты достигнуты в трех крупнейших научных ин­ститутах: в лаборатории академика В. А. Энгельгардта в Институте радиационной и физико-химической биологии Академии наук СССР (А. А. Баев, Т. В. Венкстерн, Р. И. Татарская, А. Д. Мирзабеков и дру­гие), в лаборатории члена-корреспондента Академии наук СССР Н. К. Кочеткова в Ин­ституте химии природных соединений Ака­демии наук СССР (Э. И. Будовский, М. Ф. Турчинский, Н. А. Симукова, В. П. Демушкин и другие) и в лаборатории кандида­та химических наук Д. Г. Кнорре в Институ­те органической химии Сибирского отделе­ния Академии наук СССР (Л. С. Сандахчиев, С. К. Василенко и другие).

В этих трех лабораториях достигнуты большие успехи по определению первичной структуры валиновой т-РНК. Хотя работа еще полностью не закончена, однако уже получены индивидуальные препараты вали­новой т-РНК, определен ее нуклеотидный состав, выделено и проанализировано бо­льшое число блоков. В ходе работ группой А. А. Баева был разработан новый способ получения чистого препарата РНКазы-Т₁ из актиномицетов, а группа Э. И. Будовского применила новый способ расщепления, в основе которого лежит направленное хими­ческое изменение некоторых оснований в исследуемой т-РНК. Этот способ позво­ляет значительно уменьшить число блоков, необходимое для установления их последо­вательности в исходной цепи, и, следовательно, сокращает число ферментативных расщеплений.

Над расшифровкой последовательности нуклеотидов в т-РНК работает также ряд ведущих зарубежных лабораторий, возглав­ляемых известными исследователями: про­фессором Г. Л. Кантони (США), профессо­ром Г. Цахау (ФРГ), профессором В. М. Ин­грэмом (США), профессором М. Штэйлин (Швейцария) и др.

Значение нового открытия

Транспортные РНК играют чрезвычайно важную роль в синтезе белка, «переводя» четырехбуквенный код нуклеиновой кисло’ ты на двадцатибуквенный «язык» белка. Эта их функция универсальна для всех жи­вых организмов, от бактерий до высших млекопитающих.

В результате исследований Холли мы узнали последовательность нуклеотидов, т. е. первичную структуру одной из т-РНК. Это позволяет высказать вполне опреде­ленные предположения о форме, которую может приобретать нить т-РНК в простран­стве, и помогает нам судить о том, какие из участков цепи играют особенно важную роль в функционировании т-РНК в клетке.

Весьма ценными оказались и сведения о расположении минорных нуклеотидов. До того, как была опубликована работа Холли, считалось, что приблизительно 80 процентов нуклеотидов образуют дву­нитчатые участки спаренных нуклеотидов (пурин одной нити и пиримидин другой нити), для которых характерно спиральное строение. Из работ Холли следует, что доля спирализованных участков не может быть столь большой. Это связано с тем, что миноры, большинство которых, в отличие от обычных нуклеотидов, с большим тру­дом образуют спаренные (двунитчатые) участки, не сосредоточены в одном месте, как думали многие ученые, а распределены более или менее равномерно вдоль всей цепи. Ниже пока­заны некоторые из возможных вариантов пространственного расположения молекулы ал-т-РНК с учетом распределения миноров.

Интересно, что ученые, исследующие проблему стабильности нуклеиновых кис­лот, придают очень большое значение «кооперативному» характеру взаимодействия между цепочками в двунитчатой структуре, обеспечивающему устойчивость спиральной формы нуклеиновой кислоты. Физический смысл кооперативности состоит в том, что прочность спирального участка должна воз­растать по мере увеличения числа спарен­ных нуклеотидов, образующих данный уча­сток. До работы Холли считалось, что на­блюдаемая на опыте устойчивость спираль­ной структуры нуклеиновой кислоты при температуре живого организма может быть достигнута только при условии, если спи­ральные участки будут достаточно длинны­ми. Однако исследование Холли показало, что достаточно высокая устойчивость (ко­торой, как известно, обладает т-РНК) до­стигается уже при сравнительно коротких спиральных участках, включающих всего лишь пять нуклеотидных пар и даже меньше.

Одна из замечательных особенностей молекул т-РНК состоит в том, что, хотя концы всех молекул, к которым присо­единяются аминокислоты, одинаковы (ЦЦА), тем не менее каждая из молекул «рабо­тает» строго специфически и может присо­единять какую-нибудь одну и только одну из двадцати аминокислот, для которой она предназначена.

До сих пор никому не удавалось «об­мануть» молекулу т-РНК и «нагрузить» ее не той аминокислотой, для которой она предназначена. Но если изменить амино­кислоту уже после того, как она присо­единена к т-РНК, то измененная аминокис­лота легко включается в место белковой молекулы, предназначенное для исходной аминокислоты. Из этого следует, что, если мы хотим направленно изменять структуру белка, то прежде всего должны уметь «на­гружать» т-РНК той аминокислотой, кото­рую нужно внедрить в белок, т. е. научиться управлять процессом присоединения ами­нокислоты к молекуле т-РНК.

После того, как будут расшифрованы последовательности нуклеотидов в других т-РНК, их можно будет сравнить с уже из­вестной нам последовательностью в ал-т- РНК и выяснить, в чем же заключаются различия между разными т-РНК, обуслов­ливающие их специфичность. Тогда, может быть, станет ясно, каким образом молекула т-РНК умеет находить и присоединять имен­но данную аминокислоту, как она транс­портирует ее и включает в белковую цепь. Эти сведения помогут нам научиться изме­нять по нашему усмотрению аминокислот­ную последовательность в белках и, следо­вательно, менять их структуру.

Расшифровка молекулярного строения т-РНК имеет огромное научное значение. Как справедливо указывает Холли в заклю­чение своей статьи, знание нуклеотидной последовательности открывает принципи­альную возможность химического синтеза биологически активных нуклеиновых кислот.

Работа Р. У. Холли и его сотрудников может служить яркой демонстрацией того, как достижения науки обгоняют в наши дни даже самые оптимистические прогнозы ученых и какими быстрыми шагами попол­няются наши знания о «языке», с помощью которого природа зашифровала свои тайны.

Профессор Я. М. ВАРШАВСКИЙ