Антоцианы: секреты цвета

АнтоцианыНесколько столетий назад началась одна из самых интересных и кра­сивых историй в биологической науке — история изучения цвета у растений. Рас­тительные пигменты антоцианы сыграли важную роль в открытии законов Менде­ля, мобильных генетических элементов, РНК-интерференции — все эти открытия были сделаны благодаря наблюдениям за окраской растений. На сегодняшний день биохимическая природа антоцианов, их биосинтез и его регуляция достаточно подробно исследованы. Полученные данные позволяют создавать необычно окрашенные сорта декоративных рас­тений и сельскохозяйственных культур. Голубая роза — теперь уже не сказка.

Что такое антоцианы? Немного о химии

Последнее время в российских и зару­бежных СМИ часто появляются сообще­ния о чудо-фруктах, чудо-овощах и чудо- цветах с необычной окраской, которая или не встречается у данных видов растений, или встречается, но очень редко. Фурор среди российской общественности не­давно произвела новость о новом сорте картофеля «Чудесник» с фиолетовой окраской мякоти, созданном селекци­онерами из Уральского НИИ сельского хозяйства (рис. 1).

Картофель «Чудесник»1Картофель сорта «Чудесник», который вывели уральские селекционеры

В числе овощей с не­привычной для нас фиолетовой окраской можно также упомянуть капусту, перец, морковь, цветную капусту. Заметим, что все допущенные к выращиванию в коммерческих целях сорта фиолетовых овощей, фруктов и злаков были созданы в ходе селекционной работы, это не ген- номодифицированные сорта.

Еще один пример — голубая роза, меч­та не одного поколения селекционеров и садоводов. До 2004 года синие бутоны у розы можно было получить лишь с помо­щью химических красителей, например индиго, которые впрыскивали в корни белой розы. В 2004 году методами генетической инженерии впервые в мире была полу­чена настоящая голубая роза (рис. 2).

Голубая роза2 Первая в мире голубая роза,
созданная австралийскими учеными из компании «Флориген» при поддержке японского холдинга «Сантори»

Эти и другие смелые манипуляции с окраской, которые пресса называет «чудесами», стали возможными благо­даря всестороннему исследованию природы антоциановой пигментации и генетической составляющей биосинтеза антоциановых соединений.

Сегодня достаточно хорошо изучены такие растительные пигменты, как флавоноиды, каротиноиды и беталаины. Всем известны каротиноиды моркови, а к беталаинам относятся, например, пигменты свеклы. Группа флавоноидных соединений вносит наибольший вклад в разнообразие оттенков цветов у растений. К данной группе относятся желтые ауроны, халконы и флавонолы, а также главные герои этой статьи — антоцианы, которые окрашивают рас­тения в розовые, красные, оранжевые, алые, пурпурные, голубые, темно-синие цвета. Кстати, антоцианы не только кра­сивы, но и очень полезны для человека: как выяснилось в ходе их изучения, это биологически активные молекулы.

Итак, антоцианы — растительные пиг­менты, которые могут присутствовать у растений как в генеративных органах (цветках, пыльце), так и в вегетативных (стеблях, листьях, корнях), а также в плодах и семенах. Они содержатся в клетке постоянно либо появляются на определенной стадии развития рас­тений или под действием стресса. По­следнее обстоятельство навело ученых на мысль, что антоцианы нужны не только для того, чтобы яркой окраской привлекать насекомых-опылителей и распространителей семян, но и для борьбы с различными типами стрессов.

Первые опыты по изучению антоци- ановых соединений и их химической природы провел известный английский химик Роберт Бойль. Еще в 1664 году он впервые обнаружил, что под действием кислот синий цвет лепестков василька изменяется на красный, под действием же щелочи лепестки зеленеют. В 1913— 1915 годах немецкий биохимик Рихард Вильштеттер и его швейцарский коллега Артур Шталь опубликовали серию работ, посвященных антоцианам. Из цветков различных растений они выделили ин­дивидуальные пигменты и описали их химическое строение. Оказалось, что ан- тоцианы в клетках находятся преимуще­ственно в виде гликозидов. Их агликоны (базовые молекулы-предшественники), получившие название антоцианидинов, связаны преимущественно с сахарами глюкозой, галактозой, рамнозой. «За исследования красящих веществ рас­тительного мира, особенно хлорофилла» в 1915 году Рихард Вильштеттер был удостоен Нобелевской премии по химии.

Известно более 500 индивидуальных антоциановых соединений, и число их постоянно увеличивается. Все они имеют С15-углеродный скелет — два бензольных кольца А и В, соединенные С3-фрагментом, который с атомом кис­лорода образует Y-пироновое кольцо (С-кольцо, рис. 3). При этом от других флавоноидных соединений антоцианы отличаются наличием положительного заряда и двойной связи в С-кольце.

Структура антоцианов3 Базовая структура антоцианидинов и антоцианов. Атомы углерода пронумерованы

При всем их огромном мно­гообразии антоциановые соединения — производные лишь шести основных анто- цианидинов:пеларгонидина, цианидина, пеонидина, дель- финидина, петунидина и мальвидина, которые отличаются боковыми ради­калами R1 и R2 (рис. 3, таблица). По­скольку при биосинтезе пеонидин об­разуется из цианидина, а петунидин и мальвидин — из дельфинидина, можно выделить три основных антоцианидина: пеларгонидин, цианидин и дельфинидин — это и есть предшественники всех антоциановых соединений.

Базовая структура антоцианидинов

Модификации основного С 15-углеродного скелета создают индивидуальные соединения из класса антоцианов. В качестве примера на рис. 4 при­ведена структура так называемого небес­но-синего антоциана, который окрашивает цветки вьюнка ипомеи в голубой цвет.

Возможны варианты

В какой цвет окрасят растение антоцианы, зависит от многих факторов. В первую очередь окраску определяют структура и концентрация антоцианов (она повышается в условиях стресса). Голубой или синий цвет имеют дельфинидин и его производные, красно-оран­жевый — производные пеларгонидина, а пурпурно-красную — цианидина (рис. 5).

Цветки  эустомы5 Цветки различных сортов эустомы с преобладанием пигментов — производных пеларгонидина (слева), цианидина (в центре) и дельфинидина (справа)

При этом голубой цвет обусловлива­ют гидроксильные группы (см. таблицу и рис. 4), а их метилирование, то есть присоединение СН3-групп, приводит к покраснению.

Структура синего антоциана4 Структура небесно-синего антоциана. Соединение выделено из вьюнка Ipomoea tricolor. Синим отмечены пеонидин (метилированное производное цианидина); зеленым — остатки кофейной кислоты; черным — остатки глюкозы.

Цветки вьюнка ипомеиКроме того, пигментация зависит от pH в вакуолях, где накапливаются антоциано­вые соединения. Одно и то же соединение в зависимости от сдвига в величине кис­лотности клеточного сока может приоб­ретать различные оттенки. Так, раствор антоцианов в кислой среде имеет крас­ный цвет, в нейтральной — фиолетовый, а в щелочной — желто-зеленый .

Однако pH в вакуолях может варьи­ровать от 4 до 6, и, следовательно, по­явление синей окраски в большинстве случаев нельзя объяснить влиянием pH среды. Поэтому были проведены до­полнительные исследования, которые показали, что антоцианы в клетках рас­тений присутствуют не в виде свободных молекул, а в виде комплексов с ионами металлов, которые как раз и имеют си­нюю окраску. Комплексы антоциа­нов с ионами алюминия, железа, магния, молибдена, вольфрама, стабилизи­рованные ко-пигментами (в основном флавонами и флавонолами), называются металлоантоцианинами (рис. 6).

Структура протоцианина6 Схема образования металлоантоцианина из шести молекул антоциана, флавона и двух ионов металла. Справа приведена пространственная структура протоцианина, выделенного из лепестков василька

Локализация антоцианов в тканях рас­тений и форма клеток эпидермиса тоже имеют значение, поскольку определяют количество света, достигающего пиг­ментов, а следовательно, интенсивность окраски. Показано, что цветки львиного зева с эпидермальными клетками кони­ческой формы окрашены ярче, чем цветки мутантных растений, клетки эпидермиса которых не могут принять такую форму, хотя и у тех и других растений антоцианы образуются в одном и том же количестве.

Итак, мы рассказали, чем обусловле­ны оттенки антоциановой пигментации, почему они разные у разных видов или даже у одних и тех же растений в разных условиях. Читатель может сам поэкспе­риментировать со своими домашними растениями, понаблюдав за изменени­ем их окрасок. Возможно, в ходе этих экспериментов вы добьетесь желаемого оттенка цвета и ваше растение выживет, но оно уж точно не передаст этот оттенок своим потомкам. Чтобы эффект был на­следуемым, необходимо разобраться еще в одном аспекте формирования цвета, а именно в генетической состав­ляющей биосинтеза антоцианов.

Гены синего и лилового

Молекулярно-генетические основы био­синтеза антоцианов изучены достаточно полно, чему немало поспособствовали мутанты различных видов растений с измененной окраской. На биосинтез антоцианов, а следовательно, и на окраску влияют мутации в трех типах генов. Первый — гены, которые кодируют фер­менты, участвующие в цепи биохимиче­ских превращений (структурные гены). Второй — гены, определяющие транс­крипцию структурных генов в нужное время в нужном месте (регуляторные гены). Наконец, третий — гены транс­портеров, переносящих антоцианы в вакуоли. (Известно, что антоцианы в цитоплазме окисляются и формируют агрегаты бронзового цвета, токсичные для клеток растений.

На сегодняшний день все стадии био­синтеза антоцианов и осуществляющие их ферменты известны и подробно ис­следованы методами биохимии и моле­кулярной генетики (рис. 7).

Биосинтез антоцианидинов7 Биосинтез антоцианидинов: цианидина, пеларгонидина, дельфинидина. Антоцианидины далее подвергаются реакциям модификации — гликозилированию, ацилированию, метилированию, которые осуществляют гликозилтрансферазы (GT), ацилтрансферазы (AT) и метилтрансферазы (MT). Типичная окраска, которую имеют антоцианы, образующиеся из приведенных антоцианидинов, представлена на рисунке, но она зависит от многих факторов: pH, копигментации с бесцветными флавоноидами, комплексами с ионами тяжелых металлов. Заметьте, что метилированию В-кольца (синие прерывистые стрелки) подвергаются антоцианы, а не антоцианидины. Аббревиатуры: халконсинтаза (CHS); халконфлаванонизомераза (CHI); дигидрофлавонол 4-редук-таза (DFR); флаванон-3-гидроксилаза (F3H); флавоноид-3’-гидроксилаза (F3’H); флавоноид-3’,5’-гидроксилаза (F3’5’H); антоцианидинсинтаза (ANS); флавонсинтаза (FNS); флавонолсинтаза (FLS)

Биосинтез цианидинаИз многих видов растений выделены структурные и регуляторные гены биосинтеза антоци­анов. Знание особенностей биосинтеза антоциановых пигментов у конкретного вида растения позволяет манипули­ровать его окраской на генетическом уровне, создавая растения с необычной пигментацией, которая будет переда­ваться из поколения в поколение.

Селекция и генные модификации

«Горячие точки» для модификации цве­та у растений — это главным образом структурные и регуляторные гены. Методы, с помощью которых можно модифицировать окраску растений, делятся на два типа. К первому отно­сятся методы селекции. Выбранный вид растения путем скрещивания получает гены от доноров — растений близко­родственного вида, имеющих нужный признак. Сорт картофеля «Чудесник», по словам его автора, заведующей отделом селекции картофеля ГНУ Уральского НИИ СХ, доктора сельскохозяйственных наук Е.П.Шаниной, был создан именно методом селекции.

Еще один яркий пример — это пшеница с пурпурным и голубым цветом зерна, обусловленным антоцианами (рис. 8).

Зерно пшеницы8 Пурпурное (слева), голубое (справа) и неокрашенное (в центре) .

В дикой природе пшеницу с пурпурным зерном впервые обнаружили в Эфиопии, где, по всей видимости, и появился дан­ный признак, а затем отвечающие за него гены удалось ввести методами селекции в возделываемые сорта мягкой пшеницы. Пшеница с голубым зерном в природе не встречается, но зато голубое зерно имеет родственник пшеницы — пырей. Скрещивая пырей и пшеницу и ведя от­бор по данному признаку, селекционеры получили пшеницу с голубым зерном.

В этих примерах в геном пшеницы были введены регуляторные гены. Иными словами, пшеница имеет функ­циональный аппарат биосинтеза антоцианов (все ферменты, необходимые для биосинтеза, у нее в порядке). Регуляторные гены, полученные от родственных видов, только запускают у пшеницы «машину биосинтеза антоцианов» именно в зерне.

Сходный пример, но уже с использова­нием второй группы методов манипуляции с окраской — методов генетической инже­нерии — это получение томатов с повы­шенным содержанием антоцианов. В норме спелые то­маты содержат каротиноиды, в том числе жирорастворимый антиоксидант ликопин, из флавоноидов у них были обнаружены в небольших количествах нарингенин халкон (2’,4’,6’,4-тетрагидроксихалкон, см. рис. 8) и рутин (гликозированный 5,7,3’,4’-тетрагидроксифлавонол). Вводя в растения генетическую конструкцию, со­держащую регуляторные гены биосинтеза антоцианов львиного зева Ros 1 и Del под управлением промотора E8, активного в плодах томата, международная группа ученых получила помидоры с высоким содержанием антоцианов — интенсивного лилового цвета (рис. 9).

ТоматыТоматы с повышенным содержанием антоцианов в плодах, полученные методом генетической инженерии

Все это были примеры манипуляций с регуляторными генами. Пример ис­пользования генетической инженерии изменения окраски за счет структур­ных генов биосинтеза антоцианов — пионерская работа, проведенная в 80-е годы немецкими учеными на пе­тунии. Впервые в исто­рии генно-инженерными методами была изменена окраска растения.

В норме растение петунии вовсе не содержит пигментов, производных от пеларгонидина. Чтобы разобраться, по­чему так происходит, вернемся к рис. 7. Для фермента DFR (дигидрофлавонол- 4-редуктазы) петунии самый предпочтител ьный субстрат — дигидромирицетин, менее предпочтительный — дигидрокверцетин, а дигидрокемпферол вовсе не используется в качестве субстрата. Совершенно другая картина субстрат­ной специфичности этого фермента у кукурузы, DFR которой «предпочитает» как раз дигидрокемпферол. Воору­жившись этими знаниями, Мейер ис­пользовал мутантную линию петунии, у которой отсутствовали ферменты F3’H и F3’5’H. Глядя на рис. 7, нетрудно до­гадаться, что данная мутантная линия накапливала дигидрокемпферол. А что произойдет, если ввести в мутантную линию генетическую конструкцию, со­держащую ген Dfr кукурузы? В клетках петунии появится фермент, который, в отличие от «родного» DFR петунии, спо­собен превращать дигидрокемпферол в пеларгонидин. Именно таким способом исследователи получили петунию с не­характерной для нее кирпично-красной окраской цветков (рис. 10).

Мутантная линия петунииСлева мутантная линия петунии с бледно-розовой окраской венчика из-за присутствия следовых количеств антоцианов — производные цианидина и дельфинидина, справа — генетически модифицированное растение петунии, накапливающее антоцианы — производные пеларгонидина

Однако не всегда у исследователей под рукой есть такие удобные мутанты, поэтому чаще всего при модификации окраски растений приходится «выклю­чать» ненужную ферментативную актив­ность и «включать» ту, которая нужна. Именно такой подход был применен при создании первой в мире розы с голубой окраской бутонов (рис. 2, 11).

Схема создания голубой розы11 Схема создания голубой розы. У обычных роз не образуется дигидромирицетин, поэтому в их окраске не бывает оттенков синего. У голубой розы, напротив, отключено образование красных и оранжевых пигментов

У роз, созданных усилиями селекцио­неров, окраска лепестков варьирует от ярко-красных и нежно-розовых до желтых и белоснежных. Интенсивное изучение биосинтеза антоцианов у роз позволило установить, что они не имеют F3’5’H актив­ности, а фермент DFR розы использует в качестве субстратов дигидрокверцетин и дигидрокемпферол, но не дигидроми- рицетин. Поэтому при создании голубой розы ученые выбрали следующую страте­гию. На первом этапе у розы «отключили» ее собственный фермент DFR (для этого применялся подход, основанный на РНК- интерференции), на втором — в геном розы ввели ген, кодирующий функцио­нальный F3’5’H анютиных глазок (виолы), на третьем добавили ген Dfr ириса, кото­рый кодирует фермент, производящий из дигидромирицетина дельфинидин — предшественник антоцианов с синей окраской. При этом, чтобы ферменты F3’5’H анютиных глазок и F3’H розы не конкурировали друг с другом за субстрат (то есть за дигидрокемпферол, рис. 7), для создания голубой розы был выбран генотип с отсутствием F3’H активности.

Еще один пример удивительных воз­можностей, которые открывают перед нами накопленные данные о биосинтезе флавоноидных пигментов в сочетании с методами генетической инженерии, — это получение растений торении с желтыми цветками (рис. 12).

Схема биосинтеза антоцианов и ауронов12 Схема биосинтеза антоцианов и ауронов. Снизу цветки торении, обычной, накапливающие антоцианы (слева), и трансгенной, накапливающие ауроны (справа). Обозначения: ТГХ — тетрагидроксихалкон, ПГХ — пентагидроксихалкон

Известно, что желтую окраску имеют два типа пигментов: ауроны, класс пигментов флавоноидной природы, которые окраши­вают в ярко-желтый цветки львиного зева и георгин, и каротиноиды, пигменты цветков томатов и тюльпанов. Было установлено, что ауроны у львиного зева синтезируются из халконов при посредстве двух фермен­тов —4’CGT (4’халконгликозилтрансферазы) и АS (ауреузидинсинтазы). Введение генетических конструкций с генами 4’Сgt и Аs львиного зева в растения торении (в норме цветки у них синие) совместно с ингибированием биосинтеза антоциановых пигментов привело к накоплению ауронов, и, следовательно, цветки такого растения оказались ярко-желтыми. По­добную стратегию можно использовать для получения желтой окраски цветков не только у торении, но также у герани и фиал­ки .

Приведенные примеры — это лишь малая доля манипуляций, которые уче­ные сегодня производят с биосинтезом антоцианов. Все это стало возможным благодаря исследованиям биохимиче­ской природы пигментов, а также осо­бенностей их биосинтеза у различных видов растений, как на уровне фермен­тов, так и на молекулярно-генетическом уровне. Накопленный к настоящему времени багаж знаний об антоциановых соединениях открыл неисчерпаемые возможности для создания декоратив­ных растений с необычной окраской, а также культурных видов растений с по­вышенным содержанием антоциановых пигментов. И хотя достижения селекции — необычно окрашенные овощи и фрук­ты — уже сейчас доступны покупателям в некоторых странах, декоративные растения, созданные методами гене­тической инженерии, пока еще редки. Из-за ряда нерешенных трудностей, таких, например, как стабильность на­следования модифицированной окра­ски, они еще не коммерциализированы (за исключением некоторых сортов петунии, голубой розы, лиловой гвозди­ки). Однако работа в этом направлении продолжается. Будем надеяться, что в скором времени появятся радующие глаз «чудеса науки», доступные всем любителям прекрасного.

 Кандидат биологических наук О.Ю.Шоева

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Можно использовать следующие HTML-теги и атрибуты: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>